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Analyse du transcriptome lors de l'embryogenèse précoce chez le Tournesol

Ben, Cécile (2005) Analyse du transcriptome lors de l'embryogenèse précoce chez le Tournesol. (Transcriptome analysis during early embryogenesis in sunflower.)

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Prix Léopold Escande 2005 (more)

Abstract

Chez les végétaux supérieurs, l’embryogenèse est une phase clé du développement au cours de laquelle l’embryon établit les principales structures qui formeront la future plante et synthétise et accumule des réserves définissant le rendement et la qualité nutritionnelle des graines. La compréhension des évènements moléculaires et physiologiques menant à la formation de la graine est donc d’un intérêt agronomique majeur. Le tournesol (Helianthus annuus L.), qui présente une inflorescence portant des embryons de taille relativement grande et dont le développement est synchronisé et un génome maintenant bien caractérisé, constitue un bon système expérimental pour l’étude de l’embryogenèse zygotique chez les dicotylédones. Afin de caractériser le transcriptome au cours de l’embryogenèse précoce chez le tournesol, des banques d’ADNc de référence ont été construites à partir d’embryons au stade globulaire, coeur et cotylédonaire qui constituent des stades clé du développement. Une banque d’ADNc de type SSH (Suppressive Substractive Hybridization) comparant les transcrits d’embryons aux stades coeur et cotylédonaire et enrichie en gènes préférentiellement exprimés au stade coeur a également été réalisée. Au total, 23 800 clones ont été générés dont 4 118 ont été séquencés et 1 690 séquences EST publiées (numéro d’accession : AJ827751-AJ829440). Au cours d’analyses in silico, les séquences obtenues au sein de notre laboratoire à partir des banques de référence ont été couplées à d’autres données EST issues de banques d’ADNc produites à partir d’ovules non fécondés (HadevR7) ou d’embryons cotylédonaires à des stades plus tardifs (HaDevR5 et HaDevR6) réalisées dans le cadre du programme Génoplante. L’ensemble des séquences analysées représente un total de 7 106 EST et un unigène de 3064 séquences (Ben et al., 2005). La caractérisation fonctionnelle des séquences uniques de chacune des banques d’ADNc a permis d’avoir une vue globale des fonctions cellulaires impliquées à chaque stade de développement et de leur importance relative. Les profils fonctionnels, très similaires pour chacun des stades de développement étudiés, ont montré que les embryons zygotiques sont engagés dans des processus de différenciation et présentent une activité cellulaire très élevée. Des analyses de northerns virtuels ont révélé des gènes différentiellement exprimés entre les différentes conditions. Des séquences montrant de fortes similarités avec des gènes jouant des rôles clés dans l’embryogenèse animale ou végétale ont également pu être identifiées comme, par exemple, le gène MAGO NASHI participant à l’élaboration des axes embryonnaires chez la Drosophile et dont la caractérisation moléculaire et fonctionnelle chez le tournesol a été entreprise au laboratoire. Par la suite, ces banques d’ADNc, associées à d’autres banques d’ADNc préparées à partir de tissus d’origines très diverses, ont été utilisées pour construire un microarray sur membrane nylon comptant 8 185 séquences uniques. Ce microarray a été hybridé avec des ADNc issus d’embryons dans les trois stades de développement d’intérêt (globulaire, coeur et cotylédonaire) ainsi que des ADNc préparés à partir d’ovules non fécondés et de feuilles, ces derniers échantillons représentant respectivement un témoin de tissus reproducteurs non fécondés et un témoin de tissus somatiques. L’analyse statistique des résultats de ces expériences, réalisée en pratiquant deux anovas interconnectées, a révélé 744 gènes différentiellement exprimés entre aux moins deux conditions. Une analyse plus fine, effectuée après avoir défini 4 contrastes particulièrement intéressants (embryons globulaires vs embryons coeur, embryons précoces (globulaire et coeur) vs embryons cotylédonaires, embryons (globulaire, coeur et cotylédonaire) vs ovules non fécondés et tissus reproductifs (embryons et ovules) vs feuille), a mis en évidence de 106 gènes différentiellement exprimés entre les embryons et les ovules jusqu’à 437 entre les feuilles et l’ensemble des tissus reproducteurs. L’étude du profil d’expression de ces gènes nous a permis de dégager des hypothèses sur les mécanismes induits au cours des phases précoces de l’embryogenèse chez les plantes impliquant notamment une régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle fine et spécifique à chacun des stades de développement et diverses voies de transduction du signal. La biogenèse de plastes fonctionnels ainsi que la sénescence semble également jouer un rôle essentiel dans le déroulement normal de l’embryogenèse. ABSTRACT : In higher plants, embryogenesis is a process of main importance which corresponds to the establishment of the correct embryo pattern and to the accumulation of storage reserves. Thus, the knowledge of the molecular and physiological events of this process represents a major interest for agronomy to improve grains quality and yields. However, the analysis of the early stages of development is often difficult because the embryo is small and embedded inside the maternal tissue. Sunflower (Helianthus annuus L.), which presents an inflorescence with numerous and relatively big embryos whose development is synchronized, has been proposed as a complementary model for the study of zygotic embryogenesis in dicotyledonous. In order to analyze the transcriptional program induced during the embryo patterning, reference cDNA libraries were constructed from globular, heart-shaped and early cotyledonary embryos which represent critical stages of embryogenesis. A substracted library from heart-shaped and cotyledonary embryos and enriched in transcripts from heart-shaped stage was also realized. A total of 23,800 clones was generated among which 4,118 were sequenced giving rise to 1,690 published EST. For in silico analysis, sequences from the reference libraries were coupled to EST from cDNA libraries prepared from unfertilized ovules and mid and late cotyledonary embryos. The global EST dataset represents 7,106 sequences and 3,064 potentially different genes. Functional annotation of the putative unique sequences allowed us to identify the major cell functions implicated at each stage of development revealing that embryos are engaged in active differentiation process. The EST collection analysis also led to the identification of some interesting genes such as putatively differentially expressed genes or genes with potential key roles in plant and animal embryogenesis such as Argonaute or Mago Nashi like genes. These libraries, grouped with other sunflower cDNA libraries prepared from different tissues, were used to construct a microarray containing 8,185 unique sequences. This microarray was hybridized with radiolabelled cDNA from globular, heart-shaped and cotyledonary embryos as well as unfertilized ovules and leaves used as external controls. The statistical analysis of microarray data allowed us to identify 744 differentially expressed genes between at least two conditions. The analysis of the expression profiles of those genes permitted us to build hypothesis concerning the mechanisms participating in early phases of sunflower embryogenesis. Specific transcriptional and post-transcriptional regulatory pathways as well as diverse signal transduction processes seem to be involved at each stage of this crucial phase of plant life cycle. Functional plastids biogenesis and senescence also appear to play essential roles for normal embryo development.

Department or laboratory:Laboratoire de Biotechnologie et Amélioration des Plantes - BAP (Castanet-Tolosan, France)
Directeur de thèse:Gentzbittel, Laurent
Uncontrolled Keywords:Helianthus annuus L. - Embryogenèse - EST - Banques d’ADNc - Microarray - Analyse d’expression de gènes. KEYWORDS : Helianthus annuus L. - Embryogenesis - EST - cDNA library - Microarray - Gene expression analysis.
Subjects:Biology > Molecular and cellular biology and genetics - Biotechnology
Agronomy > Plant sciences
Deposited On:21 June 2006

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