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Caractérisation fonctionnelle d'un facteur d'élongation mitochondrial LeEF-Tsmt chez la tomate. Approches par transgénèse et protéomique

Girardi, Cesar Luis (2006) Caractérisation fonctionnelle d'un facteur d'élongation mitochondrial LeEF-Tsmt chez la tomate. Approches par transgénèse et protéomique. (Functionnal caracterisation of a mitochondrial elongation factor LeEF-Tsmt in tomato. Transgenic and proteomic approaches.)

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Abstract

Cette thèse est relative à l'étude fonctionnelle d'un gène codant pour un facteur d'élongation Le-EF-Tsmt chez la tomate. Ce gène participe au processus de synthèse des protéines dans la mitochondrie et présente une forte expression au cours de la maturation par comparaison avec d'autres organes. Nous démontrons qu'il est fortement exprimé pendant les premiers stades de la maturation en parallèle avec la crise respiratoire climactérique et que son expression est stimulée par l'éthylène, la blessure et de hautes températures. Cependant, les mutants de tomate insensibles à l'éthylène présentent une expression assez élevée indiquant la présence d'un régulation indépendante de l'éthylène. Des fruits transgéniques ont été générés dans lesquels LeEF-Tsmt a été sur- et sous-exprimé de façon constitutive. Cependant, l'altération de l'expression du gène par transformation génétique avec des constructions sens et antisens de LeEF-Tsmt n.affecte pas la respiration et la production d'éthylène pendant la maturation et après blessure. De plus, l'expression du gène de l'alternative oxydase qui est connue pour jouer un rôle important dans la respiration climactérique n'est pas affectée. Toutes ces données indiquent que malgré sa forte régulation Le-EF-Tsmt n'est pas limitant de l'activité respiratoire mitochondriale. L'expression du gène LeEF-Tsmt est stimulée sous l'effet de stress oxydatifs induits dans les parties végétatives par la sècheresse et le paraquat. La sensibilité aux stress oxydatifs évaluée chez les feuilles par la présence de nécrose et dans des cals par la croissance cellulaire est réduite chez les plantes antisens. Parmi les enzymes connues pour intervenir dans la détoxication des espèces réactives d.oxygène, superoxide dismutase (SOD), catalases (CAT), peroxydases (PX) et glutathion réductases (GR), nous avons montré que la GR et les PX ont une activité accrue chez les lignées antisens permettant d'expliquer, au moins en partie, leur meilleure tolérance aux stress. Le rôle de la protéine LeEF-Tsmt dans la synthèse des protéines mitochondriales a été étudié par une analyse du protéome mitochondrial de lignées antisens et sens pour le gène LeEF-Tsmt. La comparaison des protéomes des lignées transformées et sauvage a été abordée à l'aide d'une technique de double marquage 14N/15N appliquée à des tissus de tomates cultivés in vitro. Il apparaît que les lignées sens sur-expriment fortement la protéine alors que les lignées antisens la sous-expriment faiblement. Une protéine de type «heat-shock» accompagne les variations de LeEF-Tsmt suggérant un rôle possible de chaperonne. Par ailleurs, l'analyse globale du protéome mitochondrial fournit des données générales nouvelles sur un ensemble de près de 500 protéines mitochondriales de tomate. ABSTRACT : This thesis is related to the fonctionnal study of a gene encoding an elongation factor LeEF-Tsmt in tomato. This gene participates in the protein synthesis process in mitochondria and shows strong expression in ripening fruit as compared to other organs. We demonstrate that it is strongly up-regulated during the first stages of the ripening process in parallel with the climacteric rise in respiration and that its expression is stimulated by ethylene, wounding and high temperature. However, ethylene-insensitive mutants exhibit rather high expression indicating the presence of an important ethylene-independent regulation. Transgenic fruit have been generated in which LeEF-Tsmt has been constitutively up and down-regulated. However, altering the expression of the gene by genetic transformation with antisense and sense LeEF-Tsmt constructs did not affect the pattern of respiration and ethylene production during ripening and upon wounding. In addition, expression of the alternate oxidase gene which is known to play an important role in respiratory climacteric was not affected. All these data indicate that LeEF-Tsmt, despite its strong regulation, is not limiting of the mitochondrial respiratory activity. The expression of the LeEF-Tsmt gene is stimulated by oxidative stresses induced in the vegetative parts of the plant by drought and paraquat. Sensitivity to stresses evaluated in leaves by the presence of necrosis and in calluses by cellular growth was reduced in antisense plants. Among the enzymes known for playing a role in the detoxication of reactive oxygen species, superoxide dismutase (SOD), catalases (CAT), peroxydases (PX) and glutathion reductases (GR), we have shown that GR and PX exhibit higher activity in antisense lines, thus explaining, at least partly, a better tolerance to stress. The role of the LeEF-Tsmt protein in the synthesis of mitochondrial proteins has been studied through the analysis of the mitochondrial proteome of LeEF-Tsmt sense and antisense lines. The comparison of the proteomes of the wild type and transformed lines ahas been made using dual 14N/15N labelling applied to tissues cultured in vitro. It appeared that the sense lines greatly over-express the protein while the antisense lines under-express lightly. An heat-shock protein tightly follows the variations of the LeEF-Tsmt protein suggesting a possible role of chaperon. A global analysis of the mitochondrial proteome has been performed that provides new information on a set of around 500 mitochondrial proteins of tomato.

Department or laboratory:Laboratoire de Génomique et Biotechnologie des Fruits - GBF (Castanet-Tolosan, France)
Directeur de thèse:Pech, Jean-Claude
Uncontrolled Keywords:Mitochondrie – Facteur d'élongation – Protéomique – Tomate – Fruit - Stress
Subjects:Agronomy > Plant sciences
Deposited On:14 December 2006

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