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Caractérisation de gènes de la famille des alcool deshydrogénases et alcool acyl transférases chez le melon cantaloup charentais

Manriquez, Daniel (2006) Caractérisation de gènes de la famille des alcool deshydrogénases et alcool acyl transférases chez le melon cantaloup charentais. (Characterisation of genes of the alcohol dehydrogenase and alcohol acyltransferase families in cantaloupe charantais melon.)

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Abstract

L'arôme est un des attributs principaux de la qualité des fruits. Ces composés sont synthétisés au cours du processus de maturation. Leur synthèse est sous la dépendance de l’éthylène dans les fruits climactériques tels que le melon. Un pourcentage important des composés volatils contribuant à l’arôme de nombreux fruits est constitué par des esters. La voie de biosynthèse des esters à partir d’acides gras et des acides aminés est contrôlée par deux enzymes clés, l’alcool déshydrogénase (ADH) et l’alcool acyl-transférase (AAT). L’ADH participe à l’interconversion des aldéhydes en alcools et fournit ainsi des substrats pour la formation des esters. Nous avons isolé dans cette thèse deux gènes fortement divergents codant pour des ADHs (15 % d'identité au niveau d'acide aminé) dans le melon cantaloup Charentais (Cucumis melo variété cantalupensis). Cm-ADH1 appartient à une classe d’ADHs de moyenne longueur et Cm-ADH2 à une classe à courte chaîne. Les deux protéines exprimées dans la levure sont enzymatiquement actives. Cm-ADH1 a une forte préférence pour le NAPDH comme cofacteur, tandis que Cm-ADH2 utilise préférentiellement le NADH. Les deux protéines sont plus efficaces comme réductases. Elles ont en effet des Kms 10 à 20 fois inférieurs pour la conversion des aldéhydes en alcools que pour la déshydrogénation des alcools en aldéhydes. Toutes les deux ont une forte préférence pour les aldéhydes aliphatiques. Cependant Cm-ADH1 est capable de réduire les aldéhydes ramifiés tels que le 3-methylbutyraldéhyde alors que Cm-ADH2 en est incapable. Les deux gènes sont exprimés spécifiquement dans le fruit et leur expression augmente pendant la maturation. Les transcrits des deux gènes ainsi que l’activité ADH totale sont fortement réduites dans les melons AS-ACO (AS) et dans les melons non transformés (WT) traités avec 1-MCP, démontrant que l’éthylène exerce une régulation positive sur l’expression des deux gènes d’ADH. L’AAT réalise l’acylation des alcools pour produire des esters. Nous démontrons dans cette thèse que le melon cantaloup Charentais exprime au moins quatre gènes correspondent à l’AAT : Cm-AAT1, Cm-AAT2, Cm-AAT3 et Cm-AAT4. Toutes les protéines codées par ces gènes, excepté Cm-AAT2, sont enzymatiquement actives et sont capables de produire des esters volatils lorsqu’elles sont exprimées dans la levure. Chacune de ces protéines montre des préférences spécifiques pour la formation d’esters. Cm-AAT1 est capable de produire des esters à courte et longue chaîne avec différents acyls-CoA, mais avec une préférence marquée pour la formation d'acétate d'E-2-hexenyl et d'hexanoate hexyle. Cm-AAT3 accepte également un grand nombre de substrats mais elle présente une préférence très forte pour la production d’acétate de benzylique. Quant à Cm-AAT4 elle produit presque exclusivement des acétates et a une forte préférence pour la formation d’acétate de cinnamoyle. Une mutagenèse dirigée a montré que l’absence d’activité de production d’esters volatils de Cm-AAT2 est liée à la présence d'un résidu 268 d’alanine à la place d’une thréonine alors que toutes les protéines actives étudiées jusque là possèdent cette thréonine. L’activité de chacune de ces trois protéines s’accroît fortement pendant la maturation du melon. Cependant, des melons antisens-ACC Oxydase (AS) qui ne produisent pas d’éthylène ont une très faible activité AAT. D’ailleurs, l’expression des 3 gènes Cm-AAT est fortement réduite dans le melon AS et après traitement de melons non transformés (WT) traités avec l’inhibiteur d’action de l’éthylène, 1-MCP. Ceci démontre que l’éthylène est le régulateur principal de l’expression de ces gènes. Une étude biochimique des protéines recombinantes a été réalisée. Elle montre que les protéines ont une masse moléculaire de 200 kDa environ correspondant à des tétramères. Les protéines natives extraites de melon ont une masse moléculaire identique. Les Km des trois protéines recombinantes (Cm-AAT1, Cm-AAT3 et Cm-AAT4) sont de 1,23, 1,9 et 0,15 mM vis-à-vis de l’acétyl CoA et 0,56, 0,67 et 0,32 mM vis-à-vis de l’alcool. Selon le niveau, le CoA-SH produit par la réaction peut être activateur ou inhibiteur. Des cinétiques réalisées en présence d’une enzyme capable d’éliminer l’interférence du CoA-SH (phosphotransacétylase) montrent en général un très forte diminution du Km vis-à-vis de l’acétyl CoA , sauf pour Cm-AAT3. Le Ki relatif à l’inhibition par le CoA-SH est voisin de -0,90 mM pour les trois enzymes. Les données de cette thèse suggèrent que chacune des protéines AAT et ADH joue un rôle spécifique dans la biosynthèse d'esters volatils odorants chez le melon. ABSTRACT : Aroma is one of the principal attributes of quality in fruits. Volatile compounds are synthesized during ripening. In climacteric fruit such as melon the synthesis of aroma volatiles is dependant upon ethylene. Esters represent a significant percentage of the volatile compounds participating in the flavor of many fruits. The esters biosynthesis pathway from fatty acids and amino acids is controlled by two key enzymes, alcohol dehydrogenase (ADH) and alcohol acyltransferase (AAT). ADHs perform the interconversion of aldehydes into alcohols thus providing substrates for the formation of esters. In this thesis, we have isolated two highly divergent ADH genes (15 % identity and the amino acid level) in cantaloupe Charentais melon (Cucumis melo var.cantalupensis). Cm-ADH1 belongs to the class of medium-chain ADHs and Cm-ADH2 to the class of short chain ADHs. The two proteins are enzymatically active when expressed in the yeast. Cm-ADH1 has strong preference for NAPDH as a cofactor, while Cm-ADH2 employs preferentially NADH. Both of them exhibit better efficiency as reductases with Kms 10 to 20 times lower for the conversion of aldehydes into alcohols than for the dehydrogenation of alcohols into aldehydes. They show strong preference for aliphatic aldehydes but Cm-ADH1 is able to reduce branched aldehydes such as 3-methylbutyraldehyde, while Cm-ADH2 cannot. The two ADH genes are expressed specifically in fruit and the expression increases during ripening. Gene expression and total ADH activity are strongly reduced in antisense-ACO (AS) melon and in wild type (WT) melons treated with the ethylene inhibitor 1-MCP, indicating a positive regulation by ethylene. AAT is involved in the acylation of alcohols to produce esters. We demonstrate in this thesis that cantaloupe Charentais melon express at least four members of the AAT gene family : Cm-AAT1, Cm-AAT2, Cm-AAT3 and Cm-AAT4. All the encoded proteins, except Cm-AAT2, were active in the production of esters when expressed in the yeast. Each of them shows specific preferences for the formation of esters. Cm-AAT1 is able to produce short and long-chain esters with different acyls-CoA, with a marked preference for the production of E-2-hexenyl acetate and hexyl hexanoate. Cm-AAT3 also accepts a great number of substrates but has a very strong preference for the production of benzyl acetate. Cm-AAT4 produces almost exclusively acetates, with a strong preference for cinnamoyl acetate. A site directed mutagenesis showed that the failure of Cm-AAT2 to produce esters is related to the presence of a 268-alanine residue instead of a threonine. Threonine is present in all other AATs so far characterized for being active in the formation of ester volatiles. The activity of each of the three proteins increases during ripening of untransformed wild type (WT) fruit. However, antisense-ACO (AS) melon in which ethylene production is inhibited show very low AAT activty. The expression of all three genes is strongly reduced in AS melon and in WT melon treated with 1-MCP, indicating a positive regulation by ethylene. A biochemical study of the recombinant proteins has been performed. It shows that proteins have a molecular mass of around 200 kDa corresponding to tetramers. Native proteins extracted from the melon have the same molecular mass. The Km of all three recombinant proteins (Cm-AAT1, Cm-AAT3 and Cm-AAT4) are of 1.23, 1.9 et 0.15 mM towards acetyl CoA and 0.56, 0.67 and 0.32 mM towards the alcool. Depending on the level, CoA-SH resulting from the reaction can be either activator or inhibitor. Kinetic studies performed in the presence of an enzyme capable of removing the interference of the CoA-SH (phosphotransacetylase) show in general a very strong decrease of the Km towards acetyl CoA , except for Cm-AAT3. The Ki related to the inhibition by CoA-SH is close to -0.90 mM for the three enzymes. The data of this thesis suggest that the AAT and ADH protein plays a specific role in the biosynthesis of odorant ester volatiles in melon.

Department:Laboratoire de Génomique et Biotechnologie des Fruits - GBF (Castanet-Tolosan, France)
Directeur de thèse:Latche, Alain and Pech, Jean-Claude
Uncontrolled Keywords:Arômes – Alcool déshydrogénases – Gènes – Esters volatils – Alcool acyltransférases - Melon
Subjects:Agronomy > Agro-food
Agronomy > Plant sciences
Deposited On:19 December 2006

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