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Caracterização de melões transgênicos acc oxidase antisense e estudo bioquímico de álcool aciltransferases envolvidas na biossíntese de aromas

Lucchetta, Luciano (2007) Caracterização de melões transgênicos acc oxidase antisense e estudo bioquímico de álcool aciltransferases envolvidas na biossíntese de aromas. (Caractérisation de melons transgéniques antisens acc oxydase et étude biochimique des alcools acyltransférases impliqués dans la biogenèse d'arômes.)

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Abstract

L'augmentation de la production d'éthylène est une des principales causes de l'accélération du métabolisme post-récolte de melons "Cantaloups Charentais". Dans le but de prolonger la vie post-récolte de ces fruits, les melons ont été transformés avec un clone de l´ACC oxydase (pAP4) de pomme "Royal Gala", en orientation antisens. Trois transformants ont été obtenus et le clone montrant la plus importante réduction de la production d'éthylène, appelé AS3, a été retenu pour la suite des travaux. Avec ce modèle végétal on a pu discriminer certains événements comme étant éthylène-dépendants et d´autres comme éthylène-indépendants. Par exemple, les melons AS3 ont eu un retard de maturation d’environ 10 jours et en conséquence, une accumulation de sucres plus importante. En plus, ces fruits ont préservé une plus grande fermeté de pulpe, une plus grande teneur en chlorophylles et une plus forte acidité que les non transformés. Cependant, la teneur de caroténoïdes n'a pas été modifiée par la transformation génétique. D'autre part, l'intensité aromatique des ces fruits a été réduite. Des modifications phénotypiques telles qu’une moindre sénescence des feuilles et une plus grande émission des branches latérales ont été observées. Afin de confirmer que la dégradation des chlorophylles, la perte de fermeté et la synthèse de composés volatiles étaient réellement des événements éthylène-dépendants, des fruits AS3 ont été soumis à l’action d’éthylène exogène. La restauration du processus de maturation a été seulement partielle, c'est-à-dire qu’il a y bien eu réduction de la fermeté de la pulpe mais pas de restauration complète de la production de composés volatiles, ni du jaunissement de l'écorce. Comme les plantes AS3 ont présenté des modifications de phénotype rappelant des réponses à l'action de cytokinines, on a déterminé la concentration de cette hormone dans les melons AS3 et non transformés. Nous avons ainsi trouvé que les concentrations de zéatine et de zéatine-ribose étaient 4 à 6 fois supérieures à celles des melons non transformés. Ce résultat suggère que la transformation génétique qui a conduit à une forte réduction de production d’éthylène et a eu pour conséquence de modifier le cycle végétatif des plantes, a stimulé la synthèse de cytokinines, hormones connues pour retarder la sénescence et l'action de l'éthylène. Sur d´autres melons "Cantaloup Charentais", transformés avec un clone de l´ACC oxydase de melon, appelé pMEL1, les réponses à la action d’éthylène ont été intégralement restaurées. Dans ces fruits des clones d’AAT (Cm-AAT1, Cm-AAT3 and Cm-AAT4) ont été isolés qui ont permis une caractérisation biochimique des protéines recombinantes. Ces protéines ont toutes montré une capacité à synthétiser des esters soufrés, mais la protéine Cm-AAT1 est la plus active. Ces protéines sont actives seulement sous forme tétramérique, avec un poids moléculaire autour de 200 kDa. La cinétique a montré que le CoA-SH, un des produits de la réaction, est activateur à des concentrations basses et inhibiteur à des concentrations plus élevées. L’enlèvement du CoA-SH du milieu réactionnel, via l’addition de phosphotransacétylase, s’est traduit par une réduction de la valeur du Km de 2 à 3 fois, vis-à-vis du co-substrat Acyl-CoA. Enfin, des mutations dirigées sur quelques aminoacides spécifiques dans les séquences Cm-AAT ont changé la sélectivité des enzymes et le nombre d’esters produits. ABSTRACT : The increase of ethylene production in ‘Cantaloupe Vedrantais’ melon is one of the main causes of the pre and post harvest alterations. In order to extend the shelf life of this fruit, melon plants were transformed with an ACC oxidase DNA sequence of "Royal Gala" apple in antisense orientation (pAP4). Three transformants were obtained. One of them showing the greatest reduction in ethylene production (AS3) was analysed further and used as a model to discriminate between ethylene- dependent and ethylene-independent processes during fruit ripening. AS3 melons exhibited a delay of about 10 days for ripening and accumulated more soluble solids than untransformed melons. Besides, fruit firmness, chlorophyll content and titratable acidity were higher in AS3 melons than in untransformed melons. However, the carotenoid content was unaffected and the aroma intensity was reduced in AS3 fruits. In AS3 plants the senescence of the leaves was reduced and the formation of lateral branching was increased. In order to confirm that chlorophyll degradation, cell wall degradation and synthesis of volatile compounds were ethylene-dependent events, ethylene was applied on AS3 fruits. However, the reversion of the process was limited. While the reduction of pulp firmness occurred, the production of volatiles compounds and the yellowing of the skin were not achieved. Considering that the phenotype of AS3 plants resembled a response to cytokinins action, the concentration of this phytohormone was monitored in both AS3 and untransformed melons. This hypothesis was confirmed as the cytokinins concentration in the pulp and skin of AS3 melons was fourth to eight fold higher. This result suggests that reduction in ethylene production induced changes in the vegetative cycle of the plant, and favoured the synthesis of cytokinins, hormones that are known as retardants of senescence and ethylene action. Using plants from a different lineage, "Cantaloupe" "Charentais", transformed with an ACC oxidase DNA sequence from melon, in antisense orientation (pMEL1), the responses to ethylene action were all observed. For this reason, AAT clones (Cm-AAT1, Cm-AAT3 and Cm-AAT4) were isolated for biochemical characterization. All recombinant proteins were active to synthesize sulfur-containing esters but Cm-AAT1 was the most active. Only the tetrameric form of these proteins, with molecular mass of 200 kDa, were active. The kinetic analysis indicated that CoA-SH, a product of the reaction, is an activator at low concentration and inhibitor at higher concentration. The removal of CoA-SH from the reaction medium, by adding phosphotransacetylase, resulted in Km values two to three fold lower for the co-substrate acyl-CoA. The site directed mutation of a few amino acids in the Cm-AAT sequences affected the selectivity of the original protein and the number of esters produced

Other Institution (co-tutelle):Universidade Federal de Pelotas‎ (Brasil)
Department:Laboratoire de Génomique et Biotechnologie des Fruits - GBF (Castanet-Tolosan, France)
Directeur de thèse:Rombaldi, César and Latché, Alain
Uncontrolled Keywords:Fruits – Maturation - ACC oxydase – Esters – Zéatine – Zéatine-ribose - CoA/SH. KEYWORDS : Ripening - ACC oxidase – CoA/SH – Esters – Aroma - Fruits
Subjects:Agronomy > Plant sciences
Deposited On:13 July 2007

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