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Whole genome sequence of mycoplasma mycoides subsp. Mycoides LC : application to the development of new diagnostic tools and heterologous gene expression

Salah, Woubit (2008) Whole genome sequence of mycoplasma mycoides subsp. Mycoides LC : application to the development of new diagnostic tools and heterologous gene expression. (Utilisation d'une séquence complète du génome d'une souche de mycoplasma mycoides subsp. mycoides lc pour la mise au point de tests de diagnostic, application à l'expression de gènes hétérologues.)

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Abstract

Les mycoplasmes sont des bactéries dépourvues de paroi qui dérivent de bactéries Gram plus. Il existe un groupe d'espèces, appelé le «Groupe mycoides» qui rassemble des espèces pathogènes pour les ruminants bien qu'il soit phylogénétiquement proche d'espèces pathogènes de plante. Leur génome est très réduit, environ un million de paires de bases et peu riche en G + C, environ 25 %. Parmi ce groupe, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC (MmmLC) est un agent responsable d'agalaxie contagieuse chez les chèvres. Il est très proche de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) qui est l'agent responsable de la péripneumonie contagieuse bovine et dont le génome de la souche de référence était disponible. En raison de cette proximité nous avons décidé de séquencer complètement le génome d'une souche de MmmLC afin de pouvoir réaliser des études de génomique comparative. Préalablement au séquençage et à l'assemblage, nous avons évalué la taille du génome avec la technique d'électrophorèse en champs pulsé. Nous avons pu ensuite contrôler l'assemblage obtenu en comparant les données expérimentales «in-silico» avec les résultats d'électrophorèse. De plus nous avons réalisé des «Southern blots» afin de vérifier si les séquences dupliquées chez MmmSC l'étaient également chez MmmLC. La comparaison avec les génomes complets déjà disponibles pour des souches du «Groupe mycoides» a permis d'identifier un locus intéressant pour développer des PCR spécifiques. Ce locus comprend des gènes ou des fragments de gènes appartenant chez certaines bactéries à un opéron de «voie de déimination de l'arginine». Le nombre ainsi que l'agencement et la séquence de ces gènes varie d'une espèce à l'autre au sein du «Groupe mycoides». Il a ainsi été possible de développer une PCR spécifique pour Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae, l'agent de la pleuropneumonie contagieuse caprine en amplifiant un fragment du gène arcD et une PCR spécifique de M. putrefaciens, un agent d'agalaxie contagieuse, en amplifiant un fragment du gène arcB. Pour la détection de l'ensemble des espèces du «Groupe mycoides» nous avons choisi un gène plus conservé, glk, situé en aval de l'opéron. L'annotation du génome de MmmLC a également permis d'identifier des séquences d'insertion. L'une d'entre elles, appartenant à la famille IS3, n'avait pas encore été décrite et a été appelée ISMmy2. Elle est présente chez certaines espèces du «Groupe mycoides» mais pas chez toutes les souches. Un variant de cette IS existe chez des espèces proches du «Groupe mycoides» et il en existe une copie non fonctionnelle chez MmmSC. Enfin nous avons voulu évaluer les capacités de MmmLC à exprimer des antigènes hétérologues dans le but ultime d'en faire un vecteur d'expression vaccinal. C'est pourquoi nous avons choisi un gène d'intérêt vétérinaire majeur, le gène H du virus de la peste des petits ruminants. ABSTRACT : Mycoplasmas are the smallest bacteria without a cell wall derived from Gram positive bacteria. A group of mycoplasma known as the “Mycoplasma mycoides cluster” is composed of five subspecies and an unassigned group of strains known for their pathogenicity in ruminant hosts. Phylogenetically, this cluster is found to be closely related to species of mycoplasma plant pathogens. Mycoplasmas have a reduced genome size of about 1 Mbp, characterized by a low GC content of about 25 %. Among members of the Mycoplasma mycoides cluster, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides large colony biotype (MmmLC) is one of the agents responsible for contagious agalactia in goats. This organism is closely related to Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony biotype, the causative agent of contagious bovine pleuropneumonia (CBPP), for which the whole genome sequence is available. Because of the close relationship of these two species we have decided to sequence the genome of an MmmLC strain for comparative genomics. Before whole genome sequencing and assembly, we have estimated the genome size of MmmLC using pulse field gel electrophoresis (PFGE). Data generated from this initial study have permitted us to verify the genome assembly by comparing in-silico profiles. In addition the preliminary analysis included DNA hybridization tests to verify the presence of duplicated genes in MmmLC as that of the genome of MmmSC. Comparative genomics made from the available whole genome sequence data of species within the M. mycoides cluster has permitted the identification of target genes, which were used for the development of specific PCR tests. The target genes chosen included genes of the “arginine deiminase operon”, in most bacteria genes of this operon code for enzymes involved in the degradation of arginine to produce energy. The number of these genes as well as their organization within the operon found to vary between members of the M. mycoides cluster. From this operon arcD has been used to develop a specific PCR for the identification of Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae, the causative agent of contagious caprine pleuropneumonia (CCPP), and arcB has been used for the development of specific PCR for the identification of M. putrefaciens, another causative agent of the contagious agalactia syndrome. The glk gene, flanking the operon on the 3' end, was found to be highly conserved among all members of the M. mycoides cluster and was used for the design of specific primers able to detect all members of M. mycoides cluster. Furthermore, annotation of the genome sequence of MmmLC allowed the discovery of two new insertion sequence elements. One of these two insertion sequence elements was found in higher copy in the genome and belongs to the IS3 family. This insertion sequence was not described in any other mycoplasma species or bacteria, was given a new name: ISMmy2. It was also found in some species of the M. mycoides cluster, but not in all the strains under these species. Interestingly, a non-functional vestige of ISMmy2 was also found in the MmmSC genome. Copies of this ISMmy2 were also found in species closely related to the M. mycoides cluster. Finally, we have tried to evaluate the capacity of MmmLC to be transformed and to express a heterologous gene with the ultimate aim to create a multivalent vaccine. For this aim we have chosen the H-gene of peste des petits ruminant virus of veterinary health importance

Department:Contrôle des maladies animales exotiques et émergentes – CMAEE (Montpellier, France)
Directeur de thèse:Berthelot, Xavier
Uncontrolled Keywords:Mycoplasmes - Groupe mycoides - Séquençage - PCR - Séquences d'insertion - Expression hétérologue
Subjects:Agronomy > Animal sciences
Deposited On:24 April 2008

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